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            R5421

            文字:[大][中][小] 2018-1-2    瀏覽次數:4040    

            R5421 Chemically Competent Cell 產品說明書



             

            產品規格 (CAT#: YC1080)

            R5421 Competent Cell:                                       100μl/支              保存: -80℃(3個月)

            pGADT7 (control vector, 10 ng/μl)                           10μl              保存:-80℃(12個月)

            Carrier DNA (5 μg/μl)                                              100μl              保存:-20℃(12個月)

            PEG/LiAC:                                                                    5ml              保存:    4℃(12個月)


            基因型

            MATα ura3-52 leu2 trk1Δ his3Δ200 his4-15 trk2Δ1::pCK64


            產品說明

            R5421釀酒酵母菌株為K+/鉀離子缺陷型菌株,在文獻中也稱為CY162,MATα型,多用于K+/鉀離子轉運蛋白的鑒定試驗中,也可用于K+/鉀離子通道或鈉鉀離子泵的鑒定試驗。Transformation marker為:ura3,leu2,該菌株可以在含有100mM KCl的培養基中國正常生長,在含有5-10mM KCl的培養基中生長緩慢,當培養基中KCl濃度低于0.5mM,R5421(CY162)細胞停止生長。R5421感受態細胞經特殊工藝制作,-80℃可保存三個月,pGADT7質粒檢測轉化效率>103 cfu/μg DNA。

             

            操作方法

            1. Carrier DNA 在每次使用前要通過加熱處理使其變性為單鏈狀態,步驟如下:Carrier DNA 放95℃水浴或金屬浴3 min,快速插入冰中,靜置3 min,再次放95℃水浴或金屬浴3 min,快速插入冰中,靜置3 min以上。

            2. 取100 μl冰上融化的R5421感受態細胞,依次加入預冷的目的質粒0.5-3 μg,Carrier DNA10 μl,PEG/LiAc 500 μl并吸打幾次混勻,30℃水浴30 min (15 min時翻轉6-8次混勻)。

            3. 將管放42℃水浴15 min (7.5 min時翻轉6-8次混勻)。

            4. 5000 rpm離心 40 s棄上清,ddH2O 400 μl 重懸,離心 30s棄上清。

            5. ddH2O 50 μl重懸,涂板,29℃培養48-96 h。



            注意事項


            1. 感受態細胞最好在冰上融化。

            2. 轉化高濃度的質??上鄳獪p少最終用于涂板的菌量。

            3. 同時轉化2-3種質粒時可增加質粒的用量。

            4. R5421酵母菌株對高溫敏感,最適生長溫度為27-30℃;高于31℃,生長速度和轉化效率呈指數下降。

            5. 菌落變粉不是污染,是酵母細胞生長中一個常見現象。當細胞在平板培養幾天后,平板上的Adenine被酵母消耗完畢,酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用,然而,有些菌株的ADE2基因被破壞,Adenine合成途徑受阻;又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常,所以造成中間產物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在細胞中積累而使菌落變為粉紅色。

            6. 酵母在缺陷培養基中生長速度比YPDA培養基慢,培養基中缺陷成分越多,生長越慢,以轉化涂板為例:涂YPDA平板29℃,48 h培養可見直徑1 mm克??;涂SD單缺平板29℃,48-60 h培養可見直徑1 mm克隆,涂SD雙缺平板29℃,60-80 h培養可見直徑1 mm克隆,涂SD三缺或四缺平板平板29℃,80-90h培養可見直徑1 mm克隆。



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            R5421 Chemically Competent Cell 產品說明書

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